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效应面法与酶法联用提取纹党多糖的优化工艺研究

来源:未知 发布日期:2014-08-08 14:08:50作者:admin 点击次数:
摘要:通过效应面法与酶法联用工艺提取纹党中的活性物质纹党多糖,以含量为评价指标,用单因素方差分析法研究酶解温度、酶添加量和 pH 对提取纹党多糖含量的影响;采用效应面法和对酶法联用提取工艺条件进行优化。结果显示,优化工艺为:酶解温度为 53.26℃,酶添加量为 0.09g 和 pH 值为 4.63,该工艺条件易于控制、工艺简单、成本低,在此条件下,纹党酶解后纹党多糖的含量为38.86% 。
    党参[Codonopisis pilosula(Franch)Nannf],主产于甘肃、山西、陕西、四川等省,是我国传统名贵中药材,具有补中益气,健脾益肺之功效,主治脾肺虚弱,气短心悸,食少便溏,虚喘咳嗽,内热消渴等症。甘肃省是我国中药材主要产区之一,党参主要产于甘肃定西、渭源、陇西、甘谷、平凉、岷县、临潭、卓尼、舟曲,以陇南市文县特产的纹党或晶党质量,是中国国家地理标志产品,为甘肃四大名药之一,其种植历史悠久,品质优,种植面积大,陇南文县是全国纹党的生产、加工和销售基地。
    多糖在自然界中广泛存在,是构成生命的基本生物大分子之一,其具有复杂的生物活性与功能。纹党多糖(Codonopsis Pilosula Polysaccha-ride,CPPS) 系其主要有效成分,具有免疫调节、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤等多种作用。随着植物多糖在保健和药理方面的研究和应用关注增多,研究纹党多糖在清除自由基、降血压、抗眩晕、抑菌方面具有疗效。相对于其他成分,多糖由于其水溶性和分子量大,给提取纯化带来了困难,近年来有关纹党多糖提取工艺研究的报道较多,但传统提取工艺时间长提取率低,其耗时亦较长。
    而且在提取工艺的优化时只是对单一成分进行优化设计,使得纹党资源浪费严重。为此,本文根据纹党多糖特点,用酶法和响应面法联用,进行提取工艺优化研究,节约纹党资源以及综合开发利用提供试验技术,为合理利用纹党资源和工业化生产奠定基础。
1 试验材料与方法
1.1 试验仪器与材料
    电子天平 (上海奥豪斯仪器有限公司);SK5200H 型声波清洗仪( 上海科导声仪器有限公司);RE52AA 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);HH -6 型数显恒温水浴锅(上海千载科技有限公司);TGL - 16G 型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);UV759 型紫外 - 可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司); DRT - TW型调温电热套(郑州长城科工贸有限公司);DHG- 9036A 型电热恒温鼓风干燥箱( 上海精密科学仪器有限公司)。
    纹党由甘肃省陇南市文县中寨种植基地提供;苯酚、浓硫酸、葡萄糖 (纯度 > 99.99%,sigam公司)、工业用复合酶(酶活构成为:β - 葡聚糖酶≥300 万 μ/mL,纤维素酶≥40 万 μ/mL,木聚糖酶≥260 万 μ/mL,果胶酶≥ 2 万 μ/mL ) 由和氏璧生物科技有限公司提供;其他试剂为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 纹党多糖的提取流程
    将纹党块茎在 50℃ 烘干后将其粉碎,过40目筛,用无水乙醇回流脱脂,再在 50℃时干燥,然后加入一定量的水,在一定温度下添加相应的复合酶进行一定时间的酶解提取,提取液经过减压浓缩得浓缩液,加三倍体积乙醇醇析得粗多糖沉淀,抽滤,沉淀用甲醇多次洗涤,冷冻干燥后得粗多糖样品。
1.2.2 纹党多糖含量的测定方法
    试验采用苯酚—硫酸法测定总的纹党多糖含量。先把葡萄糖用苯酚、硫酸试剂处理后,进行紫外扫描,在 489nm 处有吸收;再利用标准糖浓度和其用苯酚、硫酸试剂处理后在 489nm 处的吸光度制作标准曲线,再测定待测样品溶液的吸光度,然后根据回归方程计算相应的浓度从而求出多糖含量。苯酚试液的配制:取苯酚 100g,加铝片0.1g 和碳酸氢钠0.05g,蒸馏,收集182 ℃馏分,称取 6g,加水溶解,定容于 100 mL 棕色容量瓶(临用前新配)。取多糖干品 10.0mg,用蒸馏水定容于 100 mL 容量瓶。吸取 1.0mL 于带塞试管中,按上述步骤操作,测其吸光度,以标准曲线计算精纹党多糖含量。
纹党多糖的提取率(%)= 样品中多糖的含量稀释倍数 / 样品干重 × 。
1.3 纹党多糖的单因素试验
    分别称取 1.0g 纹党参粉末多份,分别置于250 锥形瓶中,用 100 mL 蒸馏水混匀,调节 pH 至4.8,备用。用时添加不同酶剂量搅拌匀后用保鲜膜 封 口,置 于 50 ℃ 恒 温 摇 床 培 养,转 速100 r / min,酶解 24 h,以蒸馏水为空白对照,试验重复 5 次。酶添加量对提取纹党多糖的影响:分别加入 0.02、0.04、0.06、0.08、0.09、0.10、0.11和 0.12 g 工业用复合酶;温度对提取纹党多糖的影响:取备用纹党粉末匀质液体加入工业用复合酶 0.06g,温度设置为 35℃、40℃、45℃、50℃ 、55℃ 、60℃ 和 66℃ 的恒温培养箱内酶解;pH 对提取纹党多糖的影响:在备用纹党粉末匀质液体中分别加入工业用复合酶 0.06 g,以 1 mol/LCH3COOH 溶液和 1mol / L NaOH 溶液调节成 pH值分别为 4.4、4.6、4.7、4.8、5.0、5.2 、5.5 和 6.0的系列梯度进行试验。各单因素试验后测定纹党多糖来确定适合的单因素条件。
2 试验结果与分析
2.1 多糖测定标准曲线的确立
    在试验条件下,以标准液浓度(mg/mL)为横坐标,吸光度值为纵坐标,得标准曲线,计算回归方程:y =5.1086x +0.0061,相关系数 R2= 0.9999,线性良好。
2.2 影响纹党多糖的单因素试验
    由结果分析可知,45 ~ 55℃纹党多糖的提取率之间差异较为明显,而55 ℃的纹党多糖的提取率。因此,温度选择在 45℃ 以上,考虑到酶解温度以及能量节约宜选择提取温度为 55℃。纹党多糖含量随着溶液的 pH 值的增加呈先增加后减少的趋势。当溶液的 pH 值达到 5.0 时,含量都达到值。当溶液的 pH 值过 5.0 时,多糖的溶出率反而减少,说明这时溶液的 pH 值过酶的适 pH,活性开始降低,所以 pH 值为 5.0。不同酶解浓度对纹党多糖溶出率影响,纹党多糖溶出率随着复合酶的增加而增加,纹党多糖在酶添加量为 0.06g 处增加明显,在0.09g处纹党多糖溶出率有值,此后维持稳定。说明此时酶量足够,已经与底物充分作用,因此复合酶的酶用量为 0.09g。
2.3 纹党多糖提取工艺条件响应面分析结果
    以单因素结果为依据,利用 Design Expert8.0.6.1 软件设计了三因素三水平的响应面法试验,以酶解温度、酶添加量和 pH 为主要考查因素,分别用 A、B 和 C 来表示,并以 1、0、-1 表示自变量的高低水平,以纹党多糖含量为响应值,表现出 20 个试验点。从回归分析中可以得出两者的一次项、二次项有显著影响。各试验因子对响应值的影响呈显著的线性关系。各试验因子对纹党多糖(Y)的响应值的影响分别为:
Y = -2760.05 +26.80 A+ 1085.32 B + 781.48C + 10.98 AB - 0.26AC -197.25 BC - 0.25 A2- 3679.23B2- 75.37C2。
    方差分析结果可知,模型 P <0.01 说明酶解温度、酶解浓度和 pH 值及其二次项对纹党多糖影响极显著,而交互项无显著影响。纹党多糖模型决定系数分别为 R2= 0.9990 经拟合检验,纹党多糖:P = 0.0001,差异极显著,由此说明方程很好地反映纹党多糖含量与酶解温度、酶解浓度和 pH 值之间的关系,而且根据影响纹党多糖提取率大小顺序为 B(酶添加量) > A(酶解温度) >C(pH 值)。因此,可以应用于纹党多糖含量提取的理论预测。依据回归方程在 3 个因素的响应面图 5 ~7,相应的响应面为凹型曲面,说明纹党多糖的含量响应值存在着极高值,且响应曲面的等高线中心位于 -1 ~1 之间,说明提取的优条件存在于所设计的因素水平范围之内。通过分析两者的响应面分析结果可以确定,纹党多糖的提取优工艺参数为:酶解温度 54.36℃,酶添加量0.09g和 pH 值 4.73,在此条件下,纹党多糖的含量为38.3361%。
    通过酶法和响应面法联用,对纹党多糖主要活性成分进行提取工艺优化研究,响应面分析结果确定了纹党多糖的提取优工艺参数为:酶解温度 54.36℃,酶添加量 0.09g 和 pH 4.73,在此条件 下,纹 党 酶 解 后 纹 党 多 糖 的 高 含 量38.3361% 。
    目前提取纹党多糖的方法有很多种,传统提取方法主要是水提法,操作繁琐时间长而且提取率相对较低。酶解法条件温和,操作简单,节约原材料,有较高的提取率。中药在其提取过程中会因为一些杂质类成分如淀粉、蛋白质、果胶等而影响提取液的质量,而适当的酶通过温和的酶解反应可将液体中杂质出去,从而提高体系澄清度。单独用复合酶法提取分离纹党多糖提取率相对较高,但是其耗时较长,而且酶解法中温度和 pH 值都是影响酶解产物的重要因素,它们不但影响酶的稳定性,而且还影响酶的活性中心必需基团的解离状态和底物的解离状态。在适pH 值和温度范围内,底物才能与酶充分的结合,产生大量的产物。所以用响应面法和酶解法联用将纹党多糖进行提取工艺的优化时,将温度和 pH值设计到条件,改变了以往提取时纹党资源的严重浪费,对纹党的资源开发和利用具有重要的现实意义。
来源:惠合制药设备厂
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