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沙棘叶中黄酮提取及大孔树脂分离纯化槲皮素

来源:未知 发布日期:2014-11-04 13:08:16作者:admin 点击次数:
摘 要:采用响应面的方法对热碱水提取沙棘叶中黄酮的条件进行优化,较佳工艺条件为 pH 值11. 4,温度 75. 5 ℃ ,质量浓度 28. 6 mg / mL,提取 2. 0 h,产率为 1. 23% 。 磷酸沉淀后采用大孔树脂进行纯化,比较了 3 种大孔树脂 AB-8、DM301、HPD-100 对沙棘黄酮的纯化效果,最终选较佳大孔树脂为 AB-8,且当上样液浓度为 1. 0 mg/mL、pH 值为 6. 0、吸附 1. 0 h 后,树脂的吸率达到最大值。 最后用 3 倍柱体积蒸馏水洗脱除去杂质,用不同体积分数乙醇溶液( 30%,50%,70%80%,90% ) 进行梯度洗脱,并将解吸液用高效液相色谱( HPLC) 进行检测,结果显示 80% 和 乙醇解吸液中槲皮素纯度均可到达 97%以上。
沙棘( Hippophaerhamnoides Linn。 ) 是被子植物门( Angiospermae) 木兰纲( Magnoliopsida) 蔷薇亚纲( Rosidae) 山龙眼目( Proteales) 胡颓子科( Elaeag-naceae) 沙棘属( Hippophae) 植物,又名醋柳,酸刺儿。
据报道沙棘中富含多种化学成分及生物活性物质,对儿童生长发育、中青年缓解疲劳以及老年人调节新陈代谢、减缓衰老均具有显著效果。 目前,用沙棘生产的食品有果汁饮料、汽水、香槟、啤酒、果酱、冰淇淋、明胶软糖、沙棘饼干、果脯等。 沙棘嫩叶可以制茶,它具有抗癌、消炎、抗氧化等功效,而且其咖啡碱含量低,适用于老人、小孩、高血压等神经衰弱患者。 当用沙棘叶和沙棘残渣作为补充饲料时,可使断奶仔猪增重 9. 38% ~ 21. 72%,奶山羊奶量增加 6. 24% ~ 6. 88%,蛋鸡产蛋率提高 8. 1% ~11. 3% ,产蛋量增加 24. 9% ~ 28. 7% ,并能明显增加蛋黄中胡萝卜素含量,降低胆固醇含量。 沙棘黄酮是沙棘中一类重要的活性成分,在沙棘叶中含量最高,具有生物抗氧化、清除自由基、抗衰老、降血脂、降血压、降血糖、治疗心脑血管疾病以及消炎、镇痛、抗菌和增强免疫力等作用。 目前,沙棘黄酮的提取分离方法有超声波提取法、微波提取法、水浸提法、碱性助提剂提取法、硅胶柱色谱法、大孔吸附树脂法等。 沙棘叶中总黄酮主要以苷的形式存在,采用热水浸提法提取成本低、生产过程安全、设备简单是替代乙醇萃取剂的首选溶剂。
近年来,吸附树脂法因其操作简单、成本低、环境友好、纯化效率高等优点,在天然植物有效成分的纯化以及工业化制备中发挥了越来越大的作用。 本文采用热水碱提法提取沙棘叶中黄酮并采用大孔吸附树脂进行分离纯化。
1 材料、试剂与仪器
1. 1 材料
沙棘叶,干燥叶片,实验前粉碎; 大孔吸附树脂( AB-8、DM301、HPD-100) 。
1. 2 试剂
氢氧化钠( 分析纯) 、85% 磷酸( 分析纯) 、无水乙醇( 分析纯); 芦丁标准品( 色谱纯) 、槲皮素标准品( 色谱纯); 甲醇( 色谱纯) 、乙腈( 色谱纯) 、乙酸( 色谱纯)。
1. 3 仪器
TB-214 型电子天平; RJ-TDL-5A 型低速大容量离心机; DK-98-1 型电热恒温水浴锅; T6 新世纪型紫外可见分光光度计; SHZ-Ⅲ型循环水真空泵及 RE-52AA 型旋转蒸发器; pHS-3D 型 pH 计;YS-04 型小型高速粉碎机; Agilent 1260 型高效液相色谱仪( 配有四元梯度泵、自动进样器、二极管阵列检测器、ChemStation 色谱工作站等) ,Agilent ZORBAX SB-C18柱( 250 mm ×4. 6 mm,5 μm); 大孔树脂吸附层析柱系统( 层析柱: 1. 6 cm × 30cm,DHL-A 型电脑恒流泵,DBS-100 型电脑全自动部分收集器)。
2 实验方法
2. 1 沙棘黄酮的测定方法
2. 1. 1 紫外分光度测定
以芦丁为对照品,在510 nm 下采用 Al3 +显色法测定黄酮含量。
1) 标准曲线绘制。 准确称取标准品后逐级稀释至不同浓度,测定不同质量浓度芦丁标准液,以吸光度 y 为纵坐标,质量浓度 x 为横坐标( mg/mL) 绘制标准曲线,得到回归方程 y = 11. 314x - 0. 000 6,R2= 0. 999 4。
2) 样品黄酮含量测定。 取适量样品提取液,稀释后,根据回归方程计算提取液中黄酮含量。
2. 1. 2 高效液相测定
据文献报道,沙棘黄酮中主要含有儿茶素、芦丁、槲皮素、山柰酚、异鼠李素 5 种活性物质,但根据实验需要,只选取芦丁、槲皮素两种标准品进行液相分析。
HPLC 检测方法是 Agilent ZORBAX SB-C18柱( 250 mm ×4.6 mm,5 μm) ,流速1 mL/min,柱温25 ℃,流动相 A 为含有体积分数 0. 5%乙酸的甲醇和乙腈混合液( 40∶ 15,V/V) ,流动相 B 为体积分数 0. 5%乙酸的超纯水,检测波长 279 nm。出峰时间为 10. 087 min;2 号峰为槲皮素,出峰时间为 15. 189 min。 根据文献所述方法,精密称取对照品,以不同浓度分别上样,然后以质量浓度 x( mg/mL) 为横坐标,峰面积y 为纵坐标,计算回归方程。 芦丁的标准曲线为 y =17 891x - 28157,R2= 0. 999 4; 槲皮素标准曲线为y = 41 046x - 55718,R2= 0. 999 2。
2. 2 热水碱提
取一定量干燥沙棘叶,粉碎过 50 目筛。 称量25. 0 g 沙棘叶粉,按实验计划溶解,并用 1. 0 mol / L的 NaOH 溶液和 1. 0 mol/L 磷酸溶液调节 pH 值,控制反应温度及反应时间,抽滤后用分光光度计测定。
2. 2. 1 单因素实验
各因素水平设置为 pH 值: 4. 0,6. 0,8. 0,10. 0,12. 0; 温度: 50,60,70,80,90 ℃ ; 时间: 0,0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5,3. 0 h; 质量浓度: 50. 0,40. 0,33. 3,28. 6,25. 0 mg / mL。
2. 2. 2 响应面试验
根据单因素实验结果,采用响应面设计,利用Design-Expert 7. 1. 6 软件进行 Box-Behnken 设计和实验处理,以确定较优工艺条件。 选择对黄酮浸提率有显著影响的 3 个因素: pH 值,温度,质量浓度,进行 3 因素 3 水平响应面分析试验。
2. 3 大孔树脂纯化研究
将热碱水提取液过滤后用 1. 0 mol/L 的磷酸中和至 pH 值为 7. 0,离心集沉淀,沉淀物溶解后再次调至中性,然后作为上样液进行纯化。
2. 3. 1 静态吸附和解吸实验
2. 3. 1. 1 树脂选择
根据文献选取树脂 AB-8、DM301、HPD-100 对样品中沙棘黄酮进行静态吸附、解吸。在 50 mL 1 mg/mL 的上样液中加入 5. 00 g 树脂,放入 25 ℃ 恒温水浴摇床中振荡,在不同时间 1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. 0 h 取样。 利用分光光度法计算树脂吸附值。
吸附值 =吸附前溶液浓度 - 吸附后溶液浓度树脂质量× 溶液体积。
树脂吸附饱和后,用去离子水洗涤,再用 50 mL体积分数为 70%的乙醇在 25 ℃恒温水浴摇床中解吸。 在不同时间 0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,3. 0 h 取样。 利用分光光度法计算树脂的解吸率。
解吸率 =解吸液浓度 × 解吸液体积树脂质量 × 吸附值× 100% 。
2. 3. 1. 2 单因素实验
选取树脂 AB-8 进行如下各单因素实验: 上样液 pH 值分别调至 4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. 0; 上样液质量浓度分别为 0. 2,0. 5,1. 0,2. 0,3. 0 mg/mL; 洗脱液分别为体积分数40%,50%,60%,70%,80%的乙醇。利用分光光度法计算树脂的吸附值及解吸率。
2. 3. 2 动态吸附 /解吸实验
将35 g 树脂 AB-8 装于层析柱( 1. 6 cm ×30 cm,柱体积 100 mL) 中,平衡后采用 1. 0 mg/mL pH 值为6. 0 的上样液进行吸附,流速 1. 0 mL / min,上样量150 mL,用收集器收集流出液( 10 min / 管) ,并用分光光度法测定每管流出液浓度,计算最适上样量。 吸附完毕后用3 倍柱体积的去离子水以2 mL/min 洗涤,最后再分别用体积分数 30%,50%,70%,80%,90%乙醇进行梯度洗脱,流速 1.0 mL/min,每个浓度分别洗脱 100mL,收集洗脱液,采用 HPLC 方法进行测定。
3 结果与分析
3. 1 热水碱提条件确定
3. 1. 1 提取单因素优化
不同 pH 值、温度、时间、质量浓度等因素的单因素条件对沙棘黄酮提取率的影响。 pH 值的增加使得沙棘黄酮的产率不断上升,但 pH 值过大后黄酮会被破坏,产率降低,所以较佳pH 值为 10. 0; 在温度的单因素实验中,总黄酮产率随温度的提高呈上升趋势,这是因为温度升高,加快了分子的扩散能力,但当温度达 70 ℃后,产率随温度的上升而不再改变,所以较佳提取温度为 70℃ ; 提取时间测定中,当低于 2. 0 h 时总黄酮产率随时间增加而增大,当提取时间大于 2. 0 h 后,总黄酮产率随时间变化的趋势减缓,所以选择适宜提取时间为 2. 0 h; 最后在质量浓度实验中,当质量浓度大于 33. 3 mg/mL 后,总黄酮产率趋势随质量浓度增加而变缓,即当质量浓度达到一定程度时,即使再增大质量浓度,产率也趋于稳定,此时溶剂已将有效成分基本完全溶出,所以适宜质量浓度为33.3 mg/mL。
3. 1. 2 提取响应面优化
根据单因素实验结果,选择提取时间 2. 0 h,以提取 pH 值,温度,质量浓度作为因素,采用 Box-Be-hnken 设计试验。经方差分析得到: A、A2项极其显著,B、AB、AC、B2项显著,其余项不显著,说明质量浓度、温度与质量浓度的交互作用影响弱。 pH 值、温度、质量浓度3个因素的影响顺序为: pH 值 > 温度 > 质量浓度。
各因素经二次多项回归拟合后,得到黄酮产率对 pH 值、反应温度、质量浓度 3 个因素的二次多项
回归方程: Y = - 9. 795 33 + 0. 539 87 × A + 0. 165 30 × B +0. 096 735 × C + 6. 012 50 × 10- 3× AB +8. 750 00 × 10- 4× AC - 4. 600 0 × BC -0. 045 163 × A2- 1. 439 00 × 10- 3× B2-9. 960 00 × 10- 4× C2。
响应面图能比较直观地反映各因素和各因素间的交互作用,通过多元回归方程做响应面。
根据回归方程得出理论较优的工艺条件为ph值 11. 35,温度 75. 54 ℃,质量浓度 28. 6 mg/mL,提取 2. 0 h,在此条件下提取理论值达到 1. 242%。 在pH 值为 11. 4,温度 75. 5 ℃ ,质量浓度 28. 6 mg / mL,提取 2. 0 h 条件下验证实际产率为 1. 23%,理论值与实际值误差不超过 0. 05%,结果表明,该模型可以较好地反映出沙棘叶热水碱提的条件,从而也证明了响应曲面法优化提取沙棘黄酮条件参数的可行性。
3. 2 大孔树脂静态吸附 /解吸实验
3. 2. 1 树脂选择
3 种大孔树脂对沙棘黄酮的静态吸附 / 解吸过程随时间的变化规律。
大孔树脂 AB-8 对沙棘黄酮的吸附和解吸效果明显优于树脂 DM301 和 HPD-100,且吸附饱和时间为 2. 0 h,解吸基本完全时间为 1. 5 h。
树脂 AB-8 的吸附值为 11. 35 mg/g,1. 5h 静态解吸率达到 78. 13%,选取树脂 AB-8 为较佳纯化树脂。
3. 2. 2 上样液 pH 值选择
随着上样液 pH 值的改变,大孔树脂 AB-8 对沙棘黄酮的静态吸附和解吸过程。
沙棘黄酮的吸附值和解吸率在ph值为 6. 0 时 达 到 最 高,分 别 为 11. 83 mg/g 和86. 23% ,所以上样液 pH 值较优条件为 6. 0。3. 2. 3 上样液浓度选择沙棘黄酮的吸附值和解吸率在上样液质量浓度为 1. 0 mg/mL 时达到最高值,分别为11. 23 mg / g 和 91. 12% ,所以较优上样液质量浓度为 1. 0 mg/mL。
3. 2. 4 洗脱剂浓度选择
大孔树脂 AB-8 在不同洗脱剂浓度下的解吸曲线。70% 的乙醇解吸率最高,可到达 81. 67%,应选择 70%乙醇进行解吸。
3. 3 大孔树脂动态吸附 /解吸实验
3. 3. 1 上样量确定
取 150 mL 浓度为 1 mg/mL pH 值为 6 的上样液,在装有 35g AB-8 树脂的层析柱( 1. 6 cm × 30cm,柱体积 100 mL) 中纯化,流速为 1. 0 mL / min,每10 min 收集一管流出液,用分光光度法测定每管流出液浓度计算最适上样量。
吸附中当吸附质从流出物中出现时,穿透曲线的相应点为穿透点,如果穿透曲线上升很缓慢,可取流出物质量浓度为进料质量浓度的 5%或 10% 为穿透点。当流出液达到 60 mL 时,流出液质量浓度为 0. 12 mg/mL,达到穿透点,可以停止上样。 因此,当上样液质量浓度为 1. 0 mg/mL 时,较适上样量为 60 mL。
3. 3. 2 上样液及不同体积分数洗脱液 HPLC 检测
上样液及体积分数 30%,50%,70%,80%,90% 乙醇洗脱液进行 HPLC 检测。将体积分数为 80%及 90%的乙醇洗脱液合并,冷冻干燥后称量,可得到槲皮素纯品 15. 45mg,产率为 25. 75%。
来源:惠合制药设备厂
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